Sci Adv︱华中科技大学骆海明团队开发超灵敏检测血浆外泌体上AD标志物的新方法

【经环路主题系列】技能培训班，详见文末

撰文︱胡  顺

审阅︱骆海明

责编︱王思珍

基于血浆的阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）生物标志物为AD提供了一种侵入性较小的替代性检测方法。神经系统来源的外泌体已被报道可作为AD潜在的生物标志物，但其有限的来源限制了它们在临床的应用。啮齿动物实验发现血浆来源的外泌体参与大脑中Aβ斑块的形成。但目前基于血浆来源CD63+外泌体上标志物水平与AD病程发展的相关性以及它们能否用于AD诊断的问题仍然不清楚？

针对上述问题，华中科技大学武汉光电国家研究中心骆海明教授团队开发了一种免疫磁性外泌体聚合酶链式反应（immunomagnetic exosomal PCR，iMEP）的超灵敏检测方法，实现了血浆外泌体上多种AD生物标志物的检测，并证实了血浆外泌体上AD标志物也可作为AD临床诊断的潜在标志物。有关工作于2024年3月27日在Science Advances在线发表，题目为“Sensitive detection of multiple blood biomarkers via immunomagnetic exosomal PCR for the diagnosis of Alzheimer’s disease”。

iMEP检测体系包括了血浆外泌体的提取与定量、外泌体生物标志物的免疫识别以及实时荧光定量PCR（图1），具有高特异性和超灵敏的检测性能。利用该检测方法，可对血浆外泌体上AD核心标志物（Aβ_1-42、Aβ_1-40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹）进行超灵敏检测，能够准确、有效地区分AD患者和健康者，其灵敏度和特异度能高达95%。

图1.免疫磁性外泌体PCR检测血液生物标志物的示意图

与传统免疫PCR相比，该检测方法通过设计立足点介导的DNA链置换反应去除抗体与DNA偶联产物中未结合的抗体，从而有效降低了背景信号，可以检测浓度低至10 fg/mL的生物标志物，其检测灵敏度与夹心ELISA相比提高了1000倍（图2）。

图2.免疫磁性外泌体PCR（iMEP）检测性能的评估

血浆外泌体是活细胞分泌到循环血液中的细胞外囊泡，是细胞间通讯的重要介质，可以通过传递蛋白质等物质来反映大脑生理和疾病状态。通过对比AD患者和健康者神经元来源的外泌体（NCAM⁺外泌体）与血浆外泌体（CD63⁺外泌体）中的生物标志物水平，研究团队发现血浆外泌体中的Aβ和p-tau水平显著高于神经元来源的外泌体，该现象说明了血浆外泌体可以更好地区分AD患者与健康者（图3）。

图3. iMEP在血液外泌体和神经元衍生外泌体中检测性能的比较

为了进一步评估该检测方法的临床适用性，该团队分别利用iMEP与传统ELISA（exosome-ELISA、plasma-ELISA）测定临床外泌体样本中AD生物标志物的水平，发现iMEP的检测灵敏度明显高于ELISA。而且，血浆外泌体中Aβ_1-42水平与AD病程的发展呈正相关，轻度至中度和重度AD患者的血浆外泌体Aβ_1-42水平显著高于健康个体，表明该方法或许可以用于AD病程的监测（图4）。

图4. iMEP在临床血浆外泌体中多种AD生物标志物的检测性能

文章结论与讨论，启发与展望

该iMEP检测技术在飞摩尔浓度下表现出低背景信号、高特异性和高灵敏度的独特优势。iMEP检测平台通过检测临床血浆外泌体样本上AD生物标志物（Aβ_1-42、Aβ_1-40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹），有效区分AD患者和健康个体（p < 0.0001），平均AUC值为0.90。然而，本研究中检测的临床样本量有限。考虑到后期的临床应用，需要大量的临床样本来建立可信的检测标准。iMEP技术也适用于检测外泌体中与炎症、心血管和癌症等疾病相关的蛋白标志物水平。此外，该技术还可扩展到外泌体中与脂质、炎症和代谢相关的蛋白质靶标的测定

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abm3088

华中科技大学武汉光电国家研究中心骆海明教授为文章的通讯作者，博士生胡顺为文章的第一作者，海南大学博士后张立定、同济医学院附属协和医院的苏颖副教授、博士生梁晓晗、武汉光电国家研究中心杨杰副教授、海南大学骆清铭院士为文章的共同作者。该研究工作得到了国家科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目（2021ZD0201001）、国家自然科学基金（81971025）和中国医学科学院（CAMS）医学科学创新基金（2019-I2M-5-014）的资助，并得到华中科技大学生命科学与技术学院仪器共享平台的大力支持。

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